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Die älteste Kirche auf dem höchsten Punkt der Horber Altstadt stammt wohl aus der Mitte des 13. Jahrhunderts. Damals war die Kirche allerdings eine Filiale der Pfarrkirche in Ihlingen. Erst mit der Gründung des Chorherrenstiftes durch Graf Rudolf III. von Hohenberg wurde das Filialverhältnis 1387 auch offiziell umgewandelt. Die gotische Stiftskirche wurde im 14. und 15. Jahrhundert baulich erweitert und brannte 1725 beim großen Stadtbrand vollständig aus. 1728/55 wurde das Langhaus und der Turm im Stile des Barock wieder aufgebaut. 1806 hat der König von Württemberg das Horber Chorherrenstift aufgelöst, dessen beeindruckender Kirchenschatz sich zum größten Teil erhalten hat. Das wohl bedeutendste Kunstwerk der Neckarstadt ist die sogenannte Horber Madonna im sogenannten Frauenchörle.
Von der Südseite der Stiftskirche aus hat man einen tollen Blick über die Unterstadt von Horb und ins Neckartal.